细胞滚动粘附实验--间充质干细胞在胶原蛋白I表面的血栓沉积研究

间充质干细胞在急性或慢性心肌缺血的研究中展示出其是一个非常理想的细胞治疗候选。但是，间充质干细胞在作为冠状动脉注射细胞治疗时的安全性还有待评估。一个理想的方法是使用病人自身的干细胞进行增殖后用于治疗。爱尔兰的科研人员针对间充质干细胞对于细胞治疗的安全性进行了研究。其主要针对于间充质干细胞天生的血栓前特性和在心肌梗塞后向冠状动脉迁徙治疗的安全性进行了研究。 其中，研究人员进行了了流动状态下血栓集结在胶原蛋白上的实验。同时，研究人员还用荧光底物测定的实验来研究间充质干细胞在无血小板血浆中的凝血酶的产生情况。

研究人员在做血栓沉积实验时使用ibidi流体剪切力系统，将胶原蛋白I铺在道载玻片上观测间充质干细胞在10dyn/cm2的情况下的粘附情况。

一、实验准备实验材料及设备

1）细胞： 猪分离MSC细胞（mesenchymal stem cell）

          猪源FB细胞（fibroblast）

          猪源EC细胞（endothelial cell）                         

2）培养基：Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification（α-MEM）

3）试剂： mouse anti-human TF （clone：HTF-1）

          IgG

          Collagen I

          Heparin

4）培养耗材：ibidi单通道载玻片μ-Slide I0.4 Luer （ibidi，Germany，80176）

             灌流管，15cm，1.6mm直径（ibidi，Germany，10962）

             96孔黑色免疫荧光板 （ ibidi， Germany，89626） 

5）仪器设备：ibidi流体剪切力系统，含空气泵（ibidi，Germany，10905）和流体单元（ibidi，Germany，10903）

                        Wallac Victor fluorimeter

                        multicolour fluorescent microscopy （Nikon）

二、实验方法

在实验开始前一天，请将所有需要使用的试剂，培养基，通道载玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培养箱中放置过夜，排除由于温度差产生的微量气泡。

一）细胞滚动粘附实验：

1）载玻片包被：

①　将100μl 的 250μg/ml的胶原蛋白I型溶液，注入通道中。

②　室温孵育60分钟

③　吸除所有液体并小心用PBS冲洗5-10分钟，即可开始使用

2）准备滚动粘附实验

①　搭建流体系统，灌流管按照说明放在置在流体单元上，加入少量无细胞培养基，运行去气泡程序。

②　连接通道载玻片，将上述通道载玻片中加满无细胞培养基，两侧注液孔中液体要是过满状态，之后再将灌流管和载玻片相连。

图四：a）封口夹轻轻将灌流管的硅胶管夹住。b）将其中一个鲁尔接头从中间的链接管中拔出。c-j）按图示，将鲁尔接头与通道载玻片的注液孔相连，注意不能产生气泡，会有部分培养基溢出。k）连接好后，将封口夹移除，用无尘纸将溢出的培养基擦除。l）全部连接好。

③　检查灌流系统是否密封、是否将灌流管插入了正确的阀门。将封口夹夹住其中一根硅胶管，如果两边的灌流储液管液面不会下降或者上升，那么，整个系统就是密封的，并且是正确安装的。

3）开始滚动粘附实验（单向层流）。连接好载玻片的灌流管中加入用全血血浆重悬的间充质干细胞。 再将流体单元与ibidi泵相连，以 10dyn/cm2的剪切力开始流体实验。用nikon显微镜采集图像，每5分钟拍摄一张照片。

三）凝血酶的测定--荧光底物测定实验

1）去血小板血浆可以通过2500g离心15分钟全血得到。

2）间充质干细胞重悬在去血小板血浆中，以加入HTF-1和IgG为对比，用FB和EC作为对照。

3）加入thrombin generation assay（TGA）试剂，并且用ibidi 96孔板检测凝血酶的浓度。

三 实验结果

一）滚动粘附实验

如图所示，使用全血作为对照（WB），可以看到间充质细胞有非常显著的粘附行为，而加入肝素的间充质细胞，粘附行为又有非常显著的下降。

二）凝血酶的测定

如图所示，以MSC溶血酶浓度加入α-TF比IgG要多得多。而MSC比FB也有非常显著的差异。