伤口愈合实验是体外研究细胞迁移的的一个有用的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带,然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察;这些边缘的细胞会开始进行迁移活动,并且覆盖整个无细胞的区域,重新互相接触在一起。法国的科研人员在2015年的 STEM CELL上发的文章中提出神经生长因子(NGF)和神经生长因子前体(proNGF)会自动的激活乳腺癌干细胞,并且发生侵袭。文中,使用乳腺癌细胞系和肿瘤分离的细胞进行伤口愈合实验,得出,由NGF处理的肿瘤离的乳腺癌细胞的伤口愈合速率有非常显著的提高。说明在NGF能促进乳腺癌细胞迁移活动。 Nerve Growth Factor and proNGF Simultaneously Promote Symmetric Self-Renewal, Quiescence, and Epithelial to Mesenchymal Transition to Enlarge the Breast Cancer Stem Cell Compartment E. Tomellini, Y. Touil, C. Lagadec, S. Julien, P. Ostyn, N. Ziental-Gelus, S. Meignan, J. Lengrand, E. Adriaenssens, R. Polakowska and X. Le Bourhis STEM CELLS, 2015, 10.1002/stem.1849 在文中,使用Ibidi开发的伤口愈合插件进行了伤口愈合实验。这是一种双孔的硅胶插件,可以放在培养皿中,插件两孔间的孔壁宽度为500μm。将细胞种在插件中,等待细胞贴壁长满后,将插件移除,这样,两孔间的缝隙就是一个无细胞的划痕。 一.实验材料 1) 细胞: MCF-7 、肿瘤分离细胞 2) 实验耗材: 伤口愈合插件培养皿 (ibidi, 81176) 3) 细胞培养基: MEM medium 4) 试剂: EGF (sigma, E9644) bFGF (R&D,233-FB) NGF (Scil Protein) proNGF (Alomone Labs,N-285) 5) 灭菌镊子 一.实验步骤 1.铺细胞(图三) ● 将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。 ● 在ibidi细胞插件的每孔中加入1 × 104的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。 ● 在37。C培养箱中孵育24小时。
图三:A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.在ibidi伤口愈合插件中加入细胞。 1.形成“划痕” ● 采用无血清MEM培养基培养细胞4小时 ● 如图四所示,小心的用镊子夹住插件的一个角,将插件移除。  ● 移除插件后,要用显微镜检查是否形成合格的“划痕”。 ● 小心的清洗细胞,之后加入2ml培养基进行培养(图五)。
1.采集并分析图像 ● 在显微镜下选取能同时看到划痕和两边细胞的视野进行成像,划痕的方向是水平或者垂直。 ● 采集0h和4h的图像,并且分析每张图的细胞覆盖划痕区的面积。 (三)实验结果
如图所示,ML表示MCF-7 细胞系。肿瘤分离细胞团分别由EGF、bFGF、NGF和proNGF处理,由t-EGF/bFGF、t-NGF、t-proNGF表示。可以看到由NGF处理的细胞,在4h的时候覆盖面积大,迁移速率快。
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